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Innovationen dank Proteomics

Mit Proteomics-Methoden werden die Proteine von Lebensmitteln erforscht. An der Forschungsanstalt Agroscope Liebefeld-Posieux wird so die Milchfettkügelchenhülle und die Aromabildung in Käse untersucht.

von Alimenta Import

Die Gesamtheit aller Proteine (Eiweisse) eines biologischen Systems bezeichnet man als Proteom. Anfang der 90er-Jahre des letzten Jahrhunderts entstand Proteomics als eine wissenschaftliche Disziplin, um diese Gesamtheit ­aller Proteine qualitativ und quantitativ zu ­erforschen. Moderne Proteomics-Methoden basieren auf biochemischen Trennverfahren wie die zweidimensionale (2-D) Gelelektrophorese und Flüssigchromatographie, welche mit Massenspektrometrie und Bioinformatik gekoppelt sind.
Mit Proteomics-Methoden werden komplexe Mischungen mit vielen hundert Proteinen gleichzeitig analysiert und erlauben damit einen umfassenden Einblick in die Proteinwelt eines Systems. Proteine sind nicht nur zentraler Bestandteil von Organismen, sondern auch zahlreicher Lebensmittel, weshalb diese Methoden auch wirkungsvoll für die Untersuchung von Lebensmitteln eingesetzt werden können.

Proteomics-Methoden
In einer 2-D-Gelelektrophorese werden Pro­teingemische in einem elektrischen Feld zuerst nach ihrem isoelektrischen Punkt und anschliessend nach ihrer Grösse aufgetrennt. Der isoelektrische Punkt eines Proteins bezeichnet den pH, bei welchem die Netto­ladung des Proteins null beträgt. Nach der Auftrennung werden die Proteine mit Farbstoffen sichtbar gemacht. Mit dieser Methode können Hunderte von Proteinen in einem Gel aufgetrennt und dargestellt werden. Enthält die Probe stark hydrophobe, stark saure oder stark basische Proteine, ist die Trennung mittels 2-D-Gelelektrophorese oftmals schwierig. In solchen Fällen bietet es sich an, die Proteine vor der Auftrennung in kleinere Peptide zu spalten. Da sich Peptide in Grösse, Ladung, Löslichkeit und Bindungsaffinität unterscheiden, können sie mit physikalischen Trenn­methoden getrennt werden.

Proteine und Peptide können mit Massen­spektrometrie identifiziert werden. Dazu werden die Proteine aus einem Gel geschnitten und chemisch oder enzymatisch zu Peptiden zerkleinert. Deren Grösse kann mit einem Massenspektrometer bestimmt werden. Man erhält ein Massenspektrum, welches mithilfe von Computern ausgewertet wird. Spezielle Computerprogramme wandeln die Erbinformation zu Proteinen um, zerlegen diese dann in Peptide und berechnen deren Masse. Durch einen Vergleich der gemessenen Massenspektren mit den theoretischen können die Peptide und somit das Protein identifiziert werden.

Fettkügelchenhüllenproteine in Buttermilch
Die Milchfettkügelchenhülle MFGM (milk fat globule membrane) umhüllt die Fetttropfen in der Milch und ist für den emulgierten ­Zustand des Milchfettes verantwortlich. Die Zusammensetzung und die Struktur der MFGM sind bisher nicht restlos aufgeklärt. Nach derzeitigem Kenntnisstand besteht die MFGM unter anderem aus einer proteinhaltigen Lipiddoppelschicht, deren Hauptbestandteile Fettkügelchenhüllenproteine sowie Phospho- und Glykolipide sind. An der Forschungsanstalg Agroscope Liebefeld-Posieux (ALP) werden die noch wenig erforschten Fettkügelchenmembranproteine mit Proteomics näher untersucht, da diese Proteine grosses Potenzial für neue, natürliche Produkte mit einzigartigen technologischen und gesundheitsrelevanten Eigenschaften besitzen.
Werden Proteine von Milchprodukten per Gelelektrophorese analysiert, sieht man vor allem die sechs Hauptproteine a-, b-, k-Casein, ß-Lactoglobulin, a-Lactalbumin und bovines Serumalbumin. Auch in Buttermilch, welche als Nebenprodukt bei der Butterherstellung anfällt, sind Caseine und Molkenproteine die Hauptproteine. Allerdings sind im Vergleich zu Milch die Fettkügelchenhüllenproteine angereichert. Daher ist Buttermilch ein sehr geeignetes Ausgangsmaterial, um die Eigenschaften dieser Proteine näher zu untersuchen.

Um die Fettkügelchenhüllenproteine, welche nur in Spuren vorkommen, mit einem Proteomics-Ansatz möglichst umfassend zu entschlüsseln, ist es notwendig, zuerst die in grossen Mengen vorhandenen Caseine und Molkenproteine abzutrennen.

Eine Möglichkeit, Caseine abzutrennen, ist die Fällung dieser Proteine mit Lab. Nach der Behandlung der Buttermilch mit Lab wurden die gefällten Proteine entfernt und der verbleibende Rückstand einer Ultrazentrifuga­tion unterworfen, um die Fettkügelchenhüllen­proteine zu sedimentieren. Die 2-D-Gelelektrophorese zeigte, dass mit einer Kombination aus Lab-Fällung und Ultrazentrifugation der grösste Teil der Caseine und Molken­proteine aus der Buttermilch abgetrennt wurde.
Mit der anschliessenden Massenspektrometrie wurden neben den bereits bekannten Fettkügelchenhüllenproteinen Butyrophilin, Xanthinoxidase, Mucin-1 und Adipophilin mehr als hundert weitere Proteine gefunden. Die Funktionen dieser Proteine sind bislang unbekannt und werden gegenwärtig erforscht.

Die Erkenntnisse aus diesen Proteomics-Untersuchungen können von Züchtern, Produzenten und Verarbeitern vielseitig genutzt werden. So sind MFGM zum Beispiel anfällig für Modifikationen, und mit Proteomics ist es möglich, den Einfluss der Verarbeitung auf die Funktion und Struktur der Fettkügelchenhüllenproteine zu untersuchen. Dieser Ansatz erlaubt es zudem, die Gene, welche
an der Bildung, Sekretion sowie der Zusammensetzung von Milch beteiligt sind, zu identifizieren und den Einfluss von Fütterung, Jahreszeit und genetischer Ausstattung von Rinderrassen auf die Milchzusammensetzung zu untersuchen.

Bakterieller Aromastoffwechsel
Das Aroma von Käse wird wesentlich durch die Stoffwechselaktivität von Starterkulturen und der Rohmilchflora geprägt. An ALP wird die Aromabildung in Käse erforscht. So wurde beispielsweise in zahlreichen Rohmilchkäsen am Ende der Reifung Lactobacillus casei, ein fakultativ heterofermentatives Milchsäure­bak­terium, als wesentlicher Bestandteil der Käseflora identifiziert. Es ist daher naheliegend, dass diese Spezies entscheidend an der Aromabildung beteiligt ist und Potenzial hat, als Aromabildner für Halbhart- und Hart­käsesorten eingesetzt zu werden.
Die ALP-Bakterien-Stammsammlung ent­hält L.-casei-Stämme, welche die Fähigkeit haben, aus der Aminosäure Methionin, einem Bestandteil der Caseine, flüchtige aroma­ak­tive schwefelhaltige Verbindungen zu bilden – auch L.-casei-Stämme, die diese für das Aromaprofil diverser Käse wichtigen Ver­bin­dungen nicht bilden können. Die vergleichen­de Proteomanalyse mit 2-D-Gelelektrophorese ist ein ideales Werkzeug, diesen Unterschied auf molekularer Ebene aufzuklären.

Beispielhaft sind in der Abbildung die Proteome von zwei Stämmen in der 2-D-
Gelelektrophorese dargestellt. Einer der Stämme setzt flüchtige schwefelhaltige Aromaverbindungen frei, der andere nicht. Beim Vergleich der Proteinmuster wurde ein Protein gefunden, welches nur in aromaprodu­zierenden Stämmen vorhanden ist. Mit der ­Massenspektrometrie wurde das Protein als

Cystathioninlyase identifiziert.
Cystathioninlyasen sind wichtige Enzyme im bakteriellen Schwefelstoffwechsel. Um die biochemischen und katalytischen Eigenschaf­ten des Enzyms besser zu verstehen, wurden grössere Mengen der Cystathionin­lyase mit rekombinanter DNA-Technologie hergestellt. Die Analysen zeigten, dass das Protein tatsächlich Cystathionin, aber auch die schwefelhaltigen Aminosäuren Methionin und Cystein spaltet, wobei aromaaktive flüchtige schwefelhaltige Verbindungen freigesetzt werden. So war es möglich, mit Proteomics ein Enzym zu identifizieren, welches an der mikrobiellen Aromabildung beteiligt ist und als Biomarker für die Selektion von aromabildenden Stämmen herangezogen werden kann. Zurzeit wird in Käseversuchen untersucht, ob Lactobacillus-casei-Stämme, die das Protein von Natur aus in grossen Mengen herstellen, sich als aromabildende Kulturen verwenden lassen.

*?Die Autoren arbeiten an der Forschungs­anstalt ALP  Liebefeld-Posieux, Bern.