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Molekulare Schnellmethode für den Legionellen-Test

Legionellen sind gramnegative, stäbchenförmige Bakterien, die weltweit in verschiedenen natürlichen und künstlichen Süsswasserhabitaten verbreitet sind, die Temperaturen zwischen 5 und 63 °C aufweisen.

von Alimenta Import

Filter auf einem Selektivmedium für Legionellen. Die Pfeile zeigen Kolonien der Begleitflora.

Susette Freimüller Leischtfeld, Stefan Weber, Roger Kuhn, Jürg Schmid, Lars Fieseler*. Beispiele für anthropogene Quellen sind Kühltürme, Warmwasseraufbereitungssysteme, Duschköpfe, Brunnen, Klimaanlagen, Luftbefeuchtungssysteme oder Wellnessanlagen. Legionellen sind häufig in Bio-filmen zu finden und sind natürliche Parasiten von freilebenden Protozoen (Declerck, 2009).

Bei Menschen können Legionellen sowohl Pneumonie als auch Pontiac-Fieber hervorrufen. Im Allgemeinen sind rund 90 Prozent der Legionellosen auf L. pneumophila zurückzuführen, wobei L. pneumophila-Stämme der Serogruppe 1 am häufigsten für Infektionen beim Menschen verantwortlich sind (von Baum et al., 2008). Wenn unter den Legionellen nur die Art L. pneumophila betrachtet wird, sind rund 80 Prozent der Erkrankungen auf die Serogruppe 1 zurückzuführen und ca. 20 Prozent auf die anderen Serogruppen, wobei die Serogruppe 3 und 6 dominieren (Helbig et al., 2002). Mindestens 18 weitere Spezies, darunter L. micdadei, L. dumoffi, L. bozemanii, L. longbeachae und L. jordanis können eine Infektion im Menschen hervorrufen, kommen aber weniger häufig vor (Lück, 2009; Engleberg, 2009).

Am häufigsten werden Legionellen gemäss der EN ISO Norm 11731 kulturell nachgewiesen. Für die selektive Kultivierung von Legionellen wird das Selektivmedium Glycin-Vancomycin-Polymyxin B-Cycloheximid (GVPC) eingesetzt. Nach der ISO Norm 11731 (2008) darf die Untersuchung von Proben mit niedriger Keimzahl direkt auf Buffered Charcoal Yeast Extract Agar (BCYE) erfolgen. Die beimpften Platten werden bei 35 – 37 °C für 10 Tage in aerober oder CO2-angereicherter Atmosphäre inkubiert. Nach 3, 5 und 10 Tagen Inkubation sollten die Agarplatten untersucht und das Keimwachstum beurteilt werden. Eine Begleitflora kann trotz der Wahl eines Selektivmediums für Legionellen nicht gänzlich unterdrückt werden, weshalb die präsumtiven Legionella-Kolonien nach dem kulturellen Nachweis bestätigt werden müssen (Abbildung 1). Zu diesem Zweck wurde ein Sandwich Hybridization Assay (SHA) für die Bestätigung von Legionella spp. und für die spezifische Bestätigung von L. pneumophila nach dem kulturellen Nachweis entwickelt.

Für die Bestätigungsreaktion mittels SHA wurde in einem ersten Schritt eine Mikrotiterplatte (MTP) mit einer Fängersonde beschichtet. Anschliessend wurde eine DIG markierte Detektorsonde dem System beigemischt. Danach wurden die Zellen lysiert und in die Kavitäten der MTP gegeben. In die Kavitäten der MTP hybridisierten die Fänger -und Detektorsonde mit dem Targetmolekül aus den Zellen. Die DIG-Moleküle der Detektorsonde reagierten mit dem Enzym gebunden Anti-DIG. Durch eine enzymatische Reaktion erfolgte bei positiven Befunden ein Farbumschlag. Abbildung 2 zeigt die schematische Darstellung des Vorgehens und Abbildung 3 ein Beispiel einer MTP mit positiven und negativen Befunden.

Die Fänger- und die Detektorsonde hybridisieren mit dem Targetmolekül. Die Fängersonde wurde an einer Festphase immobilisiert und der Enzym markierte Anti-DIG-Antikörper wurde an die DIG markierte Detektorsonde gebunden. Durch die Umwandlung des Substrates entsteht ein messbares Signal (mod. nach Kessler, 1991).

Die Sensitivität und Spezifität des SHA für die Bestätigung von Legionella spp. und L. pneumophila wurde anhand von 171 präsumtiven Legionellen aus 47 Wasserproben und 25 referenzierten Stämmen ermittelt. Die Sensitivität des SHA für die Bestätigung von Legionella spp. lag bei 91 % (143 von 158 Legionella-Kolonien konnten korrekterweise als Legionella spp. bestätigt werden). Die Spezifität lag bei 89 Prozent (31 von 35 getesteten Kolonien konnten korrekterweise als Begleitflora bestätigt werden). Der SHA für die Bestätigung von L. pneumophila wies eine Sensitivität von 94 Prozent (101 von 108 Kolonien konnten korrekterweise als L. pneumophila bestätigt werden) und eine Spezifität von 85 Prozent (72 von 85 Kolonien konnten korrekterweise als Begleitflora bestätigt werden) auf. Die 171 Isolate wurden zuvor mittels MALDI-TOF MS und Sequenzierung der 16S-Region identifiziert.

Das Ergebnis dieser Bestätigungsreaktion liegt bereits nach 3 Stunden vor. Darüber hinaus kann der Test visuell dank eines Farbumschlages ausgewertet werden, ohne dass ein Analysegerät benötigt wird. Der SHA eignet sich somit als zusätzliche Alternative zu den bestehenden ISO-Methoden zur Bestätigung präsumtiver Legionella spp. und L. pneumophila.

Quellen:
Declerck, P. (2009): Biofilms: the environmental playground of Legionella pneumophila. Environmental Microbiology, 12 (3): 557 – 566.
Engleberg, N. C. (2009). Legionella, Bartonella, Haemophilus. Encyclopedia of Microbiology, Third Edition, 170 – 181.
Helbig, J.; Bernander, S.; Pastoris, M. C.; Etienne, J.; Gaia, V.; Lauwers, S.; Lindsay, D. Lück, P. Marques, T.; Mentula, S.; Peeters, M.; Pelaz, C.; Struelens, M.; Uldum, S.; Wewalka, G.; Harrison, T. (2002). Pan-European Study on Culture-Proven Legionnaires’ Disease: Distribution of Legionella pneu-mophila Serogroups and Monoclonal Subgroups. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 21 (10): 710 – 716.
ISO 11731-2:2008. Water quality—Detection and enumeration of Legionella – Part 2: Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts.
Kessler, C. (1991). The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology – a survey on the concept and real-ization of a novel bioanalytical indicator system. Molecular and Cellular Probes, 5: 161 – 205.
Lück, C. (2009). Legionella spp. In: Neumeister, B., Geiss, H.K., Braun, R.W., Kimmig, P. (Hrsg.). Mikro-biologische Diagnostik, 2. vollständig überarbeitete Auflage. Stuttgart: Georg Thieme Verlag.